奶牛DNA親子鑒定檢測技術

• 親子鑒定概念

利用分子遺傳學、生物學及醫學的理論和技術，分析子代與親代之間的相似程度，來判斷親代與子代之間是否具有血緣關系。

• 親子鑒定原理

利用常染色體微衛星分型技術，選取不同染色體上的微衛星位點，采用多重PCR技術擴增微衛星標記，檢測微衛星位點的遺傳多態性，分型得出各位點等位基因的大小，通過軟件統計分析，確定或排除親子關系。

• 奶牛DNA親子鑒定技術檢測方法
  • 樣本采集：靜脈采集血樣3～5 mL，ACD抗凝，-20℃保存。對公牛，亦可采集2～3劑細管精液，液氮保存。
  • DNA提?。河梅?氯仿抽提法從奶?？鼓脱龎K中提取基因組DNA。用高鹽法從公牛精液中提取基因組DNA。
  • 引物序列：參考聯合國糧農組織(FAO)和國際動物遺傳學會(ISAG)的推薦的CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115、BM2113、ILSTS006、ETH225、TGLA227、TGLA122、BM1818、TGLA53、INRA023 12個微衛星標記引物。
  • 多重PCR擴增：產物擴增分4次PCR反應完成。同一擴增組合的引物加入同一PCR反應管中。25 µL反應體系：10×Buffer 2.5 µL、50 mmol/L MgCl₂ 1.2 µL、10 mmol/L dNTP 0.6 µL、Taq DNA聚合酶2 U、10 µmol/L引物(擴增組合)各1.0µL、待測個體模板DNA 100 ng、加雙蒸水至反應總體積為25 µL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57～60.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。
  • PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測：配置1％的瓊脂糖凝膠，將待檢PCR產物5 µL和上樣緩沖液以5:1的比例混合均勻，加入點樣孔。5 µL 500bp DNA Marker作參照。恒壓100 V，電泳40 min。電泳結束后在凝膠成像系統上觀察和拍照，分析結果。
  • 微衛星DNA多態性分析：PCR產物、去離子甲酰胺和FAM/HEX/TAMRA內標按 0.5 µL: l0 µL: 0.5 µL比例混合，95℃變性5 min，ABI PRISM 3100儀器測序，ABI PRISM 3100 DATA COLLECTION軟件分析微衛星的基因型。
  • 微衛星標記分型：利用ABI3100儀器對微衛星標記進行基因分型。檢測個體的12個微衛星標記的基因分型結果，根據相對熒光強度和片段大小，獲得待測個體不同STR標記的基因型。不同親緣關系的個體，其微衛星標記的等位基因大小不同，表現出不同的基因型。
  • 親子關系判定：根據待檢個體STR標記的基因型，利用Cervux30軟件分別計算其親子指數（Parternity index）的LOD值（對數值）。當LOD＞0時，候選親本有可能是真實的親代，LOD值最高的個體是最相似的親本個體；當LOD<0時，候選親本不可能是真實的親本。

?    微衛星標記分型